gerak


widgets

love gt raibon


Minggu, 05 Februari 2012

Ekstraksi DNA Ikan dengan Metode Salting Out

Ekstraksi DNA Ikan dengan Metode Salting Out
Dewasa ini ekstraksi Whole DNA metode Salting Out banyak dipakai oleh para peneliti genetika di bidang ikan karena memakai garam (NaCl) dan deterjen (sodium dodecyl sulphate / SDS) yang ramah lingkungan dan tidak beracun sebagai bahan baku.

1. Sebelum memulai, siapkan dahulu Lysis Buffer, Proteinase K 20 mg/ml, NaCL 6 M, Isopropanol, Ethanol 70%, dan Tris-EDTA alias TE 1x.

a. Cara membuat 20 mL Lysis Buffer, masukkan ke tabung propilen 50 ml bahan-bahan sbb:
NaCl 0.4 M, jika stok yang tersedia 1 M, maka ambil 1,33 mL.
Tris-HCl pH 8.0
EDTA 2 mM pH 8.0
20% SDS (konsentrasi akhir 2%)
Air Destilasi, isi sampai total campuran mencapai 20 mL
b. Cara membuat 1 mL Proteinase K dengan konsentrasi 20 mg/ml, masukkan ke tabung eppendorf 1.5 mL bahan-bahan sebagai berikut:
Proteinase K (dari pabrik biasanya bentuk bubuk) sebanyak 0.02 g
CaCl2 10 uL
Tris-HCl 20 uL
Gliserol 500 uL
Air Destilasi 470 uL
campurkan hingga semua bahan-bahan semuanya larut, lalu bungkus tube dengan aluminium foil. Simpan di freezer suhu -20 derajat Celcius

2. Masukkan Lysis Buffer sebanyak 400 uL kedalam tabung eppendorf 1.5 mL dan Proteinase K 20 mg/mL sebanyak 10uL.

3. Gunting secuil sirip ikan (1 x 1 mm), masukkan ke Lysis buffer dan hancurkan atau potong kecil-kecil sampai lembut dengan gunting kecil.

4. Inkubasi dalam waterbath suhu 55 derajat celcius selama semalam.

5. Keesokan harinya, angkat tabung eppendorf dari waterbath, tambahkan NaCl 6M sebanyak 300 uL, bolak-balikkan tabung selama sekitar 1 menit agar larutan homogen.

6. Putar di sentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit - suhu kamar.

7. Angkat, dan pindahkan supernatan (cairan yang bening) ke tabung eppendorf 1.5 mL yang baru sebanyak 450 uL dengan menggunakan micropipet . Awas....bagian keruh dari endapan jangan sampai terambil.

8. Pada supernatan, tambahkan isopropanol sebanyak 450 uL, bolak-balikkan tabung selama sekitar 1 menit agar larutan homogen, lalu simpan di freezer suhu -20 derajat Celcius selama satu jam.

9. Setelah satu jam, masukkan ke sentrifus dan putar dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit - suhu normal.

10. Buang supernatan dengan cepat agar endapan DNA di bagian bawah tidak ikut terbuang. Lalu tambahkan Ethanol 70%. Bolak-balikkan tabung selama sekitar 1 menit sampai homogen.

11. Putar di sentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit - suhu kamar.

12. Buang supernatan dengan cepat agar endapan DNA di bagian bawah tidak ikut terbuang, lalu keringkan tabung dalam kondisi terbalik dengan tutup terbuka seperti pada gambar berikut:

13. Setelah kering (biasanya sekitar 1-1.5 jam) tambahkan TE 1x sebanyak 50 uL, lalu inkubasi ke waterbath suhu 65 derajat celcius selama 1 jam.

Sekarang anda sudah punya DNA didalam tabung tersebut. Untuk mengecek konsentrasi DNA yang baru saja anda ekstrak / isolasi. Anda bisa menggunakan Nanodrop spektrofotometer atau melalui 1% Agarose Gel elektroforesis dengan membandingkannya dengan Lambda DNA, atau standard ladder yang telah diketahui konsentrasinya.

Whole DNA siap untuk dipakai. Selamat mencoba !

Untuk bahan bacaan lebih lanjut silahkan baca

Aljanabi, S.M. and I. Martinez (1997). Universal and Rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acid Research 25 (22): 4692-4693.

Mengenai saya

Foto saya
., ., Indonesia
Golongan Darah"B",Rh+, islamic, kawin

Daun bertaburan anms

BLOG BUNDANYA NAZWA DAN RAIHAN

BLOG BUNDANYA NAZWA-RAIHAN-TERIMAKSIH ATAS KUNJUNGANNYA